Journal of Natural P d u t s Vol. 5 0 , NO.2 , pp. 277-280, Mar-Ap 1987
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ATTRIBUTION COMPLETE DES SIGNAUX DU SPECTRE DE RMN 13CDU GOSSYPOL A L’AIDE DES TECHNIQUES A DEUX DIMENSIONS L I M E LACOMBE, Lahatoire de Chimie des Interadom Molkulaires, CNRS U A 285, Collige de France, I I , Place Marcelin Bertklot, 7523I Paris Cedex 0 5 , France
ANGELIIUDALKAFOUKI, et NICOLEKUNESCH L h a t o i r e de Chimie des Substances Thirapeutiques Naturelles, CNRS U A 496, Centre &Etudes Pharmareutiques, 92296 Ch2tenay-Malabry Cedex, France
Le gossypol [la] est un pigment jaune polyphknolique t e e n i q u e isolC principalement des graines de diffkrents cotonniers du genre Gossypium (1). Des etudes effectuees en Chine ont montre que son administration orale induit une stCrilitC chez l’homme (2). Ce compose est donc l’objet de recherches actives en tant qu’anticonceptionnel masculin, bien qu’il soit toxique (3) et que son mode d’action ne soit pas encore totalement Glucide (4-6).
Des travaux rkcents indiquent que le gossypol ou ses derives possedent de plus une activiti antivirale (7), antimalarique (8,9), et une action trypanocide sur le trypanosome (10,ll). Etant donne I’intkrCt croissant du gossypol, il semble dbormais utile de dCterminer quels elements structuraux sont associes A I’activite biologique. I1 est bien etabli que le gossypol existe sous plusieurs formes tautomeres la, 2, et 3, particulierement observables en
3
2
HO
A lb
rrnn ‘H ou 13C suivant les solvants utilises pour ces analyses (12,13). Ce fait entraine des difficult& de separation et d’identification des derivb du gossypol puisque les formes hemiacetal cycliques TAFKEAU 1. carbone no.
15b 7
deux dimensions, mettant en evidence les constantes de couplage yc-H et pour completer l’attribution des carbones quaternaires du gossypol [la] (Tableau 1).
vc-H
Analyse des Scectres de Rmn
Y C - H et Y C - H
a
corrklations 2D
CDC13/D20
191 d
149,9 142,9
I3C du Gossypol [I
multiplicitC YC-H
CDCI, 198,2 155,6
Wol. 50, No. 2
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1 6
5 5 +d
H15,H12C
H,,,H12‘
m affid
133,6
5
H4
m affine 133,l 1292 117,6 115,4 1141
3 10
111,2
8
4b
6 6
158
H,,CH, en 11 H4
2 9
d d 27,4 27,4 19,8
12 11 13 14
CH, en 11
4 5 ; 1,5
130 129,5 129,5
7 18; 5 18
H15rH12C
t’ t’ te
Toncentration de la: saturation dam CDCI, (0,2M),G=dCplacernent chimique en ppdTMS; ]=constante de couplage en Hz; Abkviations: s=singulet, d=doublet, q=quadmplet, m=multiplet, dd=doublet d6doublt. bcarbones dont les dkplacements chimiques ont dCji CtC attribub antirieurement (12). ‘taches correspondant i de trk faibles intensit& de codlation. dfconstanks de couplage non directement observables Ctant donn& la complexitC du signal. 'tie domaine d’observation du spectre de corrClation 13C-1Ha CtC IimitC, pour le carbone 13 i la partie aromatique.
de type 2 peuvent Ctre egalement isolkes
(1~4). C’est la raison pour laquelle il nous a paru nkcessaire d’attribuer avec precision les valeurs de resonance des carbones, en rrnn du carbone 13, du gossypol sous sa forme l a dans le CDCI,, afin de s’appuyer avec certitude sur ces d o n n h pour toute etude de relation structureactivite ou de mecanisme des reactions biologiques. Les techniques classiques de rrnn 13C(spectresavec et sans decouplage du proton) ne nous ont permis d’elucider qu’une partie du problkme. I1 a fallu recourir au spectre de correlation 13C-lH i
Dans les attributions qui vont suivre, nous utiliserons le fait bien connu que les constantes de couplage yc+,sont, dans les systkmes aromatiques, plus importantes (7 Hz) que les constantes de couplage ’J ou 9 (2 Hz) ( 15). A la concentration utilisee, on observe dans le spectre de rrnn ‘H un couplage J H - H = ~ Hz entre deux hydrogknes phknoliques dont l’un, rksonnant i 15 ppm, est implique dans une liaison avec I’aldChydeen 15. Ceci permet de reviser ‘La numtroiation des carbones utili& ici s’appuies u r I’originebiogCnCtique t e e n i q u e du gossypol (20) et suit celle du squelette farnbyle.
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Lacombe et al. : RMN 13Cdu Gossypol
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rnents chimiques qui sont en excellente concordance avec les valeurs calcul&s pour le modkle Ib en utilisant les increments dkterminb dans de cas des naphtalkKs substituks (17,18). Le doublet ddoublk i 111,2 pprn correspond au carbone 8 en raison de son couplage ’J avec le proton aldkhydique dont la valeur, relativement faible pour un couplage de ce type (18 Hz), est dQe i I’existence d’un groupement phenolique en ortho (19). Le quadruplet v = 6 Hz) qui se trouve a 133,l ppm est dQ au carbone 3, par suite de sa correlation avec les protons du
les valeurs des dkplacements chimiques a t t r i b u h antkrieurement (16) aux hydrogknes des phenols: H1(6,40 pprn), H6(6,06 ppm), H7(15,05 ppm) et explique que les couplages entre carbones et hydrogknes phenoliques aient pu Ctre aisement observes. Nous avons mis A profit ces couplages 133C-1Hpour I’attribution des carbones 1,6,7 porteurs des fonctions phenols et le repi5rage des carbones voisins 2,5,8, et 9. Dans ce but, deux spectres ont et6 enregistrb, I’un dans CDCI,, I’autre aprks addition d’eau lourde (Figure 1).
N
1 m.
N
I
I
1%.
j
i ‘4 FIGURE 1. Spectre de rmn I3C non dicouplk du gossypol [la] CDC13+D,0
Les signaux des trois atomes de carbone associks aux phenols apparaissent a 142,9, 149,9, et 155,6 ppm. L’un d’eux, A 149,9 ppm est un singulet (Figure 1) et ne donne aucune correlation, tandis que les deux autres carbones sont couplks avec le proton aldkhydique en 15 et avec le proton en 12 du reste isopropyle (Tableau 1). Ceci fixe donc la resonance du carbone phknolique en 1 i 149,9 ppm. Les deux autres carbones dont les signaux, aprks addition d’eau lourde (Figure l), se simplifient en doublet ( v C 7 - H 1 5 = 5 Hz, 155,6 ppm)et multiplet affink ( 1 4 2 3 ppm) ont des dkplace-
a:
dans CDCI,; b: dans
methyle en 11. Le carbone resonnant a 115,4 pprn est le seul i prbenter une double corrklation avec H4 et les protons du methyle en 11 et ne peut Ctre que le carbone 2, tandis que la valeur de 114,l ppm est attribuie au carbone 9 du fait de sa corrklation avec H4. Le multiplet i 133,6 pprn s’affine aprks addition d’eau lourde (Figure l),ce qui situe le carbone correspondant au voisinage d’un phenol. De plus, sa correlation avec H, permet d’affecter cette valeur au carbone 5. Le signal restant, situ6 a 129 ppm est donc celui du carbone 10. Bien qu’il apparaisse sous la forme d’un doublet de-
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double, dans les conditions expkrimentales utilis&s, nous n’avons pas pu observer de correlation avec les protons voisins. En conclusion, les techniques d’analyse en rmn de 13Crnises en oeuvre ici ont donc perrnis l’attibution definitive de tous les carbones du gossypol [la). Les valeurs consignk dans le Tableau 1 sont en bon accord avec les valeurs calculkes figurant sur la formule du rnodd e lb.
5.
6. 7. 8.
9.
PARTIE EXPERIMENTALE Le gossypol a ttt isole sous forme de gossypolacktique, des graines d’une variCtC cultide de Gosrypium d o n la mtthode de Carruth (2 l), avec un rendement de 0,65%. Les spectres de rmn I3C ont CtC enregist& i 50,3 MHz sur un appareil Bruker AM200 SY 6quipi de I’ordinateur ASPECT 3000, d m CDCI, ainsi que dans CDCI, additionnk d’une petite quantitC d’eau lourde. L’expkience de cordation 13C-’H a deux dimensions a utilis6 la dquence d’impulsion suivante: 90’1 ‘HI-%t 180°[ l3C)-%t -7,-90” [’H)-90°[13C]-~,-BB[’HlFIDI‘3Cl-t2 (22) et un programme de phase permettant une dCtection en quadrature dans les deux dimensions (23), ainsi que des dClais T~ (70 ms) et T 2 (35 ms) adapt& i I’observation de constantes de couplage de I’ordre de 7 Hz. Les largeurs spectrales ont CtC respectivement en proton et en carbone 13, 10 ppm et 166 ppm. La matrice finale de 256 sur 2048 points a CtC obtenue gdce i 192 acquisitions de 128 spectres ayant 2048 points chacun. Elk a CtC trait& par multiplication gaussienne dans les deux dimensions avant transformation.
10.
11. 12.
13. 14.
15. 16. 17. 18.
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Receiwd I 9June I986
