In Operando Investigation of Electrical Coupling of ... - ACS Publications

Jun 9, 2017 - Vera Eßmann†, Fangyuan Zhao†, Volker Hartmann‡, Marc M. Nowaczyk‡, Wolfgang Schuhmann† , and Felipe Conzuelo†. †Analytica...
0 downloads 0 Views 666KB Size
Article

In operando investigation of electrically coupling of photosystem 1 and photosystem 2 by means of bipolar electrochemistry Vera Essmann, Fangyuan Zhao, Volker Hartmann, Marc M Nowaczyk, Wolfgang Schuhmann, and Felipe Conzuelo Anal. Chem., Just Accepted Manuscript • Publication Date (Web): 09 Jun 2017 Downloaded from http://pubs.acs.org on June 12, 2017

Just Accepted “Just Accepted” manuscripts have been peer-reviewed and accepted for publication. They are posted online prior to technical editing, formatting for publication and author proofing. The American Chemical Society provides “Just Accepted” as a free service to the research community to expedite the dissemination of scientific material as soon as possible after acceptance. “Just Accepted” manuscripts appear in full in PDF format accompanied by an HTML abstract. “Just Accepted” manuscripts have been fully peer reviewed, but should not be considered the official version of record. They are accessible to all readers and citable by the Digital Object Identifier (DOI®). “Just Accepted” is an optional service offered to authors. Therefore, the “Just Accepted” Web site may not include all articles that will be published in the journal. After a manuscript is technically edited and formatted, it will be removed from the “Just Accepted” Web site and published as an ASAP article. Note that technical editing may introduce minor changes to the manuscript text and/or graphics which could affect content, and all legal disclaimers and ethical guidelines that apply to the journal pertain. ACS cannot be held responsible for errors or consequences arising from the use of information contained in these “Just Accepted” manuscripts.

Analytical Chemistry is published by the American Chemical Society. 1155 Sixteenth Street N.W., Washington, DC 20036 Published by American Chemical Society. Copyright © American Chemical Society. However, no copyright claim is made to original U.S. Government works, or works produced by employees of any Commonwealth realm Crown government in the course of their duties.

Page 1 of 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Analytical Chemistry

In operando investigation of electrically coupling of photosystem 1 and photosystem 2 by means of bipolar electrochemistry Vera Eßmann,a Fangyuan Zhao,a Volker Hartmann,b Marc M. Nowaczyk,b Wolfgang  Schuhmann,a,* and Felipe Conzueloa,*  a

  Analytical Chemistry ‐ Center for Electrochemical Sciences (CES), Ruhr‐Universität Bochum, Universitätsstr.  150, D‐44780 Bochum, Germany  

b

  Plant Biochemistry, Ruhr‐Universität Bochum, Universitätsstr. 150, D‐44780 Bochum, Germany 

* Corresponding authors: [email protected][email protected], Fax: +49 234 3214683 

ABSTRACT: Electrochemical communication between two photobioelectrochemical half‐cells based on photosystem 1 and  photosystem 2 is investigated in operando. The driving force for the electron transfer reactions is applied in a wireless mode  using bipolar electrochemistry with the actual electrode potentials being self‐regulated by the redox processes. Four pa‐ rameters are assessed to understand the overall performance and elucidate the limiting reactions of the photobioelectro‐ chemical cell. In addition to the potential differences for oxidation and reduction reactions, the current flowing between  the half‐cells as well as in situ collection of locally evolved O2 by photosystem 2 using a positioned SECM tip are evaluated.  In this way, changes in the enzymatic performances as a result of inactivation of either of the protein complexes or variations  in the external conditions are monitored. 

KEYWORDS: photosystem 1, photosystem 2, bipolar electrochemistry, redox polymers, biophotovoltaics  Oxygenic  photosynthesis  is  the  most  relevant  energy  transformation process on earth. It allows the conversion  of  sunlight  into  chemical  energy.1‐3  The  process  is  per‐ formed by a complex machinery developed by nature and  driven by two key protein complexes, namely photosystem  1  (PS1)  and  photosystem  2  (PS2).  Both  of  them  undergo  charge separation upon absorption of visible light, operat‐ ing with a high quantum yield. PS2 catalyses the light dri‐ ven oxidation of water, whereas PS1 operates as an ‘electron  pump that fuels the subsequent assimilation of CO2 into  organic matter.4  The  extraordinary  efficiency  and  natural  abundance  of  the photosynthetic protein complexes has raised consider‐ able interest in the realisation of sustainable solar energy  devices. By integration of the photosynthetic protein com‐ plexes to electrodes, the development of semi‐artificial bi‐ ohybrid photovoltaic assemblies aims at the generation of  photocurrent  and  light‐driven  hydrogen  production.3,5  Strategies for the connection of individual photosystems to  various electrode surfaces have been widely reported.6‐8 As  shown  previously,5  higher  photocurrent  densities  can  be  attained by embedding photosynthetic protein complexes  into  redox  polymers,  which  simultaneously fulfil the role  of a non‐leaking redox mediator and a three‐dimensional  immobilisation  matrix,  thereby  increasing  the  electron  transfer rate and the amount of protein complexes that can  be  productively  immobilised  on  the  electrode  surface.9,10 

Of particular interest is the design of photocatalytic bioe‐ lectrochemical cells with coupled PS1 and PS2, capable of  mimicking the overall photosynthetic process. Here, water  as the only electron source is oxidised at the water‐oxidis‐ ing complex (WOC) in PS2, allowing electron flow all the  way  to  the  reducing  end  of  PS1.  Different  architectures  have been suggested for the development of efficient bio‐ photoelectrodes  taking  advantage  of  the  coupling  of  PS1  and PS2.8 Moreover, functional photosynthetic biophoto‐ voltaic  cells  were  described  by  coupling  of  PS1‐  and  PS2‐ modified  electrodes  for  successful  autonomous  solar‐to‐ chemical energy conversion.11,12 The only report to date on  the study of electron transfer between isolated PS1 and PS2  has been performed by coupling of the protein complexes  encapsulated in sol‐gel glasses using a 2,6‐dichloropheno‐ lindophenol (DCPIP) pool as electron carrier and monitor‐ ing the specific absorption of the chlorophyll radical cat‐ ion,  P700+•.13  To  design  more  useful  and  refined  biophoto‐ voltaic devices, it is of importance to understand and eval‐ uate  the  efficiency  of  electron  transfer  between  coupled  photosynthetic protein complexes.  In a conventional analytical systems the interfacial potential  at  the  working  electrode  is  controlled.  In  contrast,  by  using  bipolar electrochemistry (BPE) it becomes possible to investi‐ gate the activity of both protein complexes simultaneously in  a  more  autonomous  way,  because  the  measured  potentials  and currents are defined by the activities of the protein com‐ plexes instead of being controlled by an externally applied po‐

1

ACS Paragon Plus Environment

Analytical Chemistry

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

tential.  With  bipolar  electrochemistry,  oxidation  and  reduc‐ tion  reactions  can  be  carried  out  at  the  opposite  ends  of  an  electrically  conductive  object  that  is  not  wired  to  a  potenti‐ ostat. Many publications report on the use of BPE for various  purposes  such  as  for  wireless  sensors,14  locomotion  of  small  objects,15 or material gradients.16,17 In a closed bipolar system,  as used in this study, the two opposite ends of a conducting  object of any shape (e.g. an ITO‐stripe,18 two RDEs,19 etc.) are  placed in two different compartments.17,20 In order to apply an  electric field, a pair of so‐called feeder electrodes is used, lo‐ cating one of them in each of these two compartments. In this  way, the conductive object, being the only electrical connec‐ tion  between  the  compartments,  is  polarised  and  thus  be‐ comes a bipolar electrode (BE). The BE potential is floating to  a value in between the solution potentials in the two compart‐ ments. As a result, potential differences of opposite direction  are  induced  at  the  BE  extremities.  With  a  sufficiently  high  voltage  applied  to  the  feeder  electrodes,  the  potential  drop  across the BE (∆EBE) drives oxidation and reduction reactions  at the BE. The required ∆EBE is approximately equal to the dif‐ ference of the formal potentials measured for each reaction in  a conventional three‐electrode setup. Also here, the redox re‐ action which is proceeding at a lower rate is limiting the cou‐ pled reaction at the opposite BE extremity.21 A closed bipolar  system has the advantage that the bipolar and the feeder elec‐ trode  currents  are  equal  due  to  elimination  of  ionic  current  between the poles. This effect has mostly been exploited in the  field  of  analytical  BPE  for  quantification  of  analytes  such  as  H2O2,18 for characterisation of catalysts19 or for the determina‐ tion of solution conductivity.22 The behaviour of closed bipo‐ lar systems, e.g. as a function of the sizes of the BE poles, has  been investigated previously.21,23 

Page 2 of 8

Materials. Au surfaces were prepared by vapour deposi‐ tion in a metal vaporisation setup (Leybold Univex 300) de‐ positing 50 Å of titanium as an adhesion layer and a 1000 Å  thick Au layer on Si(100) wafers (Wacker). The wafers were  cut precisely to (8 × 5) mm² rectangles by laser cutting at  the  chair  of  Electronic  Materials  and  Nanoelectronics  (Ruhr‐Universität  Bochum).  Organic  contaminants  were  removed by immersion in a freshly prepared piranha solu‐ tion  (H2SO4  from  Sigma‐Aldrich;  H2O2  from  VWR,  3:1  (v/v)) for 10 min (Caution! Piranha solution is highly corro‐ sive and a powerful oxidising agent. This solution must be  handled  with  extreme  care).  Afterwards,  the  surface  was  rinsed thoroughly with ultrapure water. A thin strip of cop‐ per  tape  was  attached  to  the  edge  of  the  Au  surface  and  insulated, leaving (5 × 5) mm² of Au surface electrochemi‐ cally accessible. For the cathodic extremity of the bipolar  electrode, the same procedure was repeated using two rec‐ tangles to increase the electrochemically accessible surface  area to (10 × 5) mm².  The  synthesis  and  purification  of  the  redox  polymer  poly(1‐vinylimidazole‐co‐allylamine)‐Os(bpy)2Cl  has  been  shown previously.9,24 Isolated PS1 trimers from the thermo‐ philic cyanobacterium T. elongatus were prepared follow‐ ing a previous report.10 PS2 was isolated from T. elongatus  according to a previously reported procedure.25 For control  measurements the protein complexes were inactivated by  thermal treatment using a silicone oil bath at 120 °C for 1 h.  A 50 mM sodium citrate buffer (pH 4) containing 100 mM  KCl, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, and 2 mM 1,1’‐dimethyl‐ 4,4’‐bipyridinium (methyl viologen, MV2+, Sigma‐Aldrich)  was used for PS1 and inactivated PS1 (iPS1) samples. For PS2  and inactivated PS2 (iPS2) samples, 50 mM 2‐(N‐morpho‐ lino)ethanesulfonic  acid  (MES,  Biomol)  buffer  (pH 6.5)  containing 50 mM KCl, 15 mM MgCl2, and 15 mM CaCl2 was  used.  All  solutions  were  prepared  with  ultrapure  water  (ρ = 18 MΩ cm, SG Water).  Sample preparation. For sample preparation, 2.5 µL of  a  mixture  of  the  redox  polymer  (5 µg µL‐1),  poly(ethylene  glycol) diglycidyl ether (PEGDGE, 0.02 µg µL‐1, Polyscien‐ ces), and isolated photosystem (PS1 or PS2, 1 µg µL‐1) were  dropped onto the surface of the Au wafer. In case of PS1 or  iPS1,  the  sample  was  incubated  overnight  in  the  dark  at  4 °C. Prior to measurements the Au surfaces modified with  PS1 or iPS1 were incubated with 50 mM Tris‐HCl buffer so‐ lution  (pH 9,  containing  100 mM  KCl,  10 mM  MgCl2,  and  10 mM  CaCl2)  for  30 min  to  induce  polymer  collapse  and  crosslinking.26 PS2 or iPS2 samples were incubated for 1 h  in the dark at 4 °C.  

Here, we demonstrate coupling of two light‐induced re‐ dox reactions at a BE in a closed bipolar system to assess  the electrochemical behaviour of both half‐cells individu‐ ally  while  they  are  in  electrical  contact  with  each  other.  The BE was modified with isolated PS1 and PS2, both em‐ bedded in the redox polymer poly(1‐vinylimidazole‐co‐al‐ lylamine)‐Os(bpy)2Cl, at the cathodic and anodic pole, re‐ spectively. This electrode architecture has previously pro‐ ven to exhibit high photocurrents with both protein com‐ plexes, hence ensuring controlled conditions for the eval‐ uation  of  electrode  potentials  and  electron  transfer.9,10,24  Constant operation of the system was ensured by applying  an  electric  field  via  the  feeder  electrodes.  The  response  upon illumination was studied. By recording the resulting  changes in the overall system current through the feeder  electrodes,  the  O2  reduction  current  at  a  SECM  tip  posi‐ tioned above the PS2‐modified end of the BE, and the two  interfacial  potential  differences  at  the  BE  poles,  infor‐ mation  on  the  activity  of  both  protein  complexes  can  be  obtained simultaneously and in operando. Since the BE ex‐ tremities  are located  in  different  compartments,  working  conditions for the two biomolecules can be individually ad‐ justed.  Moreover,  this  study  provides  interesting  insights  into the working principle of closed bipolar systems. 

Experimental  setup.  Two  petri  dishes  (ø = 87 mm)  were  used as the two compartments of the closed bipolar setup (see  Scheme 1). In each of them a stainless steel plate was placed at  the  outer  rim  serving  as  feeder  electrode.  For  application  of  the driving voltage, the two plates were connected to a power  supply (33120 A, arbitrary waveform generator, HP). The cur‐ rent between the feeder electrodes was measured with a mul‐ timeter (CEM). 

EXPERIMENTAL SECTION

2

ACS Paragon Plus Environment

Page 3 of 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Analytical Chemistry

RESULTS AND DISCUSSION Bipolar electrochemistry for in operando measurements A closed bipolar system was used (Scheme 1). The two ex‐ tremities of the BE are located in two different compartments,  which are only electrically connected by the BE. The anodic  (BEa)  and  cathodic  (BEc)  poles  of  the  BE  are  two  Au  wafers  modified with PS2 and PS1, respectively, embedded in the re‐ dox polymer poly(1‐vinylimidazole‐co‐allylamine)‐Os(bpy)2Cl  (Os‐P).  Application  of  a  driving  voltage  between  the  feeder  electrodes supports electron transfer between the two BE ex‐ tremities modified with the protein complexes. Since the re‐ dox potential of the redox polymer is 0.19 V vs. Ag/AgCl (3 M  KCl),  the  interfacial  potential  difference  at  the  two  poles,  ∆EBEa‐Sol and ∆EBEc‐Sol, needs to be adjusted to drive the oxida‐ tion and reduction reactions at the BE (see Scheme S‐1). In ad‐ dition to regulating the applied driving voltage, the potential  differences can be fine‐tuned via the size of the poles, in this  case the dimensions of the Au wafers.27 A suitable range for  the  interfacial  potential  differences  avoiding  side  reactions  like extensive O2 reduction is achieved by an applied voltage  of 0.6 V and using a cathodic pole with twice the size of the  anodic pole. 

  Scheme 1. Schematic of the closed bipolar electrochemistry  setup. A stainless steel sheet was placed in each cell compart‐ ment as feeder electrode for application of the driving voltage.  The cathodic BE pole is modified with PS1 embedded within  an  Os‐complex  modified  redox  polymer  (visualised  by  the  brown  spot)  and  has  twice  the  surface  area  than  the  anodic  pole,  which  is  modified  with  PS2  embedded  in  the  same  Os‐complex  modified  polymer  (brown  spot).  Both  poles  are  illuminated  simultaneously.  Interfacial  potential  differences  are measured with two reference electrodes positioned close  to the BE poles. O2 is collected in‐situ at a Pt‐microelectrode  positioned 5 µm above the PS2‐modified surface. Additionally,  the system current is monitored. 

The system  allows us  to investigate the  electrical com‐ munication between PS1 and PS2 embedded in the redox  polymer in operando by monitoring four parameters sim‐ ultaneously,  i.e.  the  system  current  between  the  feeder  electrodes  isys,  the  interfacial  potential  differences  at  the  two poles ∆EBEc‐Sol and ∆EBEa‐Sol, and the O2 reduction cur‐ rent  at  a  microelectrode  positioned  close  above  the  PS2‐ modified  area  of  the  BE  for  the  collection  of  O2  evolved  upon water splitting. isys directly reflects the electron trans‐ fer between PS2/Os‐P and PS1/Os‐P induced upon irradia‐ tion, corresponding to electron flow from water as electron  source  at  the  PS2  side,  to  the  reducing  end  of  PS1  where  MV2+ acts as a fast redox mediator for the final reduction  of  O2  in  solution.  Since  the  potential  of  the  bipolar  elec‐ trode is floating between that of the solution potentials in  the  two  compartments,  the  maximum  possible  current  flow is adjusted and the final electrode potentials are de‐ fined by the performance of the photosystem protein com‐ plexes upon irradiation. Consequently, a change in work‐ ing conditions influencing the activity of PS1 and PS2, such  as  light  intensity,  solution  composition  or  availability  of  electron donors and acceptors, is mirrored in the recorded  values. As proved experimentally (data not shown), an ad‐ ditional  system  current  originates  from  the  common  ground of the potentiostat and the power supply, however  with no influence on the recorded parameters more than  an offset in isys. 

While the PS1‐modified twin Au wafer was attached to the  bottom of one petri dish at the rim opposite of the feeder an‐ ode,  the  PS2‐modified  wafer  was  positioned  opposite  of  the  feeder cathode in the other petri dish. The PS1 compartment  was  filled  with  citrate  buffer  pH  4.0  containing  2  mM  MV2+  and  the PS2 compartment was filled  with MES  buffer of pH  6.5. The  copper  tape  strips of both  poles  were  connected.  A  Pt‐microelectrode  (ø = 25 µm)  was  positioned  directly  above  the  PS2‐spot  at  a  distance  of  about  5 µm  and  connected  as  working  electrode  to  a  potentiostat  (IPS).  A  Ag/AgCl  (3 M  KCl) electrode was used as reference electrode and positioned  close to the wafer  surface. A Pt‐wire  served  as  counter elec‐ trode, which was positioned more distantly. An additional pair  of Ag/AgCl (3 M KCl) electrodes were placed close to each pole  of the BE and connected via  a multimeter (CEM) to the BE.  Irradiation of the samples was performed with an LC8 type 03  lamp  (Hamamatsu  Photonics)  using  visible  light  at  an  inci‐ dent power of 55 mW cm‐2. 

BPE  measurements.  An  experimental  sequence  was  defined for the bipolar experiments scheduling the times  at which the voltage and light was switched on and off (Ta‐ ble S‐1). Briefly, the system was first kept at OCP for about  3 min. Prior to a sequence of light and dark periods, a volt‐ age  of  0.6 V  was  applied  to  the  feeder  electrodes.  Subse‐ quently,  the  response  in  the  absence  of  the  electric  field  was investigated followed by recording the response over a  long‐term irradiation period of approximately 10 min. Dur‐ ing  the  entire  procedure,  the  interfacial  potential  differ‐ ence at both BE poles, the feeder current, and the SECM  tip current for the collection of evolved O2 (Etip = −0.6 V)  were monitored. 

Electrical communication between PS1 and PS2 A  series  of  different  light  and  potential  conditions  was  defined to investigate the electrochemical communication  between PS1 and PS2 (Table S‐1). The first half of the exper‐ imental  sequence  provides  extensive  information  on  the  extent of light‐induced electron transfer and its reasons. In  addition, the working stability of both protein complexes  is studied in the second half. For sake of simplicity, the data  for the second part is shown in the Supporting Information 

3

ACS Paragon Plus Environment

Analytical Chemistry

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Page 4 of 8

(Figure S‐1 and S‐2). The responses obtained for fully active  PS1 and PS2 at BEc and BEa, respectively, are presented in  Figure 1.  Initially,  the  system  was  kept  at  OCP.  After  the  power  supply  is  switched  on,  the  applied  electric  field  causes an increased system current (Figure 1a). According  to ∆EBEa‐Sol and ∆EBEc‐Sol (Figure 1c, d), the initial peak in isys  can be ascribed to the oxidation and reduction of the Os‐ complex  within  the  redox  polymer.  Illumination  of  the  samples after approximately 7 min enables the photosyn‐ thetic processes according to Scheme S‐1. This is reflected  by  rapid  changes  in  all  four  monitored  parameters.  The  system  current  increases  by  about  1.5 µA  and  slowly  de‐ creases as inactivation of the protein complexes takes place  over time. As a result of the light‐activated water splitting  process at PS2 also the SECM tip current increases signifi‐ cantly (Figure 1b). The additional current through the sys‐ tem causes a decrease in the overall potential drop across  the BE, ∆EBE (∆EBEa‐Sol − ∆EBEc‐Sol). Importantly, the cathodic  interfacial potential difference ∆EBEc‐Sol decreases while the  anodic potential difference ∆EBEa‐Sol slightly increases. We  suggest that this indicates which redox process requires a  higher driving force. Since the overall oxidation and reduc‐ tion  reactions  at  the  BE  proceed  at  the  same  rate,  the  slower reaction does not only limit the opposite bipolar re‐ action but also the overall system current. Consequently,  the whole equilibrium of potentials including ∆EBEc‐Sol  and  ∆EBEa‐Sol  is  continuously  adjusted  to  achieve  the  maximal  possible  current.  From  the  resulting  potential  changes  upon the decrease in charge transfer resistance through il‐ lumination, it is possible to determine the limiting reaction  and presumably also to estimate the degree of limitation.  If,  for  example,  the  reduction  reaction  requires  a  lower  driving  force  to  reach  the  maximal  oxidation  current,  ∆EBEc‐Sol would  be  decreased  while  ∆EBEa‐Sol  would remain  constant  or  increase.  This  hypothesis  is  evaluated  by  the  implemented  control  measurements  (see  below).  The  modulation of potential differences in the coupling of PS1  and PS2 upon illumination indicates the anodic reaction to  be  limiting,  which  is  attributed  to  the  sensitivity  of  PS2  leading  to  faster  inactivation.  After  10 min,  Vapp  was  switched off for almost 1 min. Without the external driving  force, no redox reactions are enabled so that no system cur‐ rent and no increase in tip current were recorded.  For a second and long‐term illumination period (Figure  S‐1), the same trends as before are observed. Irradiation for  over 10 min under Vapp was performed to monitor the op‐ erational stability of the isolated protein complexes. Again,  a peak in isys is recorded at similar potential differences as  before.  As  isys  decreases,  ∆EBEa‐Sol  and  ∆EBEc‐Sol  are  first  shifted  to  more  positive  potentials  meaning  that  PS2  re‐ quires  a  higher  driving  force  to  deliver  the  current  while  PS1 is able to attain it at lower potential differences. After  12 min, ∆EBEa‐Sol and ∆EBEc‐Sol  reach a maximum shift and a  peak  is  recorded  in iSECM.  After  this  point,  ∆EBEa‐Sol  de‐ creases while ∆EBEc‐Sol remains unchanged as the loss in  

  Figure 1. Data recorded in the bipolar setup for the evalua‐ tion of electrical communication between redox‐polymer em‐ bedded PS1 and PS2. Sample illumination is indicated by the  bright  yellow  background  and  the  application  of  0.6 V  bet‐ ween the feeder electrodes is indicated by the shaded boxes at  the  bottom  and  top  of  the  graphs.  a)  Current  between  the  feeder electrodes isys, b) current at the SECM tip iSECM, c) in‐ terfacial  potential  difference  between  BEa  and  the  solution  ∆EBEa‐Sol,  and  d)  interfacial  potential  difference  between  BEc  and the solution ∆EBEc‐Sol. 

4

ACS Paragon Plus Environment

Page 5 of 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Analytical Chemistry

activity  of  the  immobilised  PS2  becomes  significant.  Consequently, less electrons can be delivered causing the  overall driving force ∆EBE to decrease. As soon as the light  is switched off, isys declines by approximately 0.8 µA indi‐ cating residual activity. This is accompanied by a drop of  the reduction current at the SECM tip back to the initial  value  and  a  small  increase  in  ∆EBE  as  the  charge‐transfer  resistance  increases  again.  As  photosynthetic  redox  pro‐ cesses do not contribute to the current anymore, the po‐ tentials shift to enable other redox reactions. In this way,  oxidation reactions occurring at lower anodic potential dif‐ ferences  are  balanced  by  reduction  reactions,  such  as  O2  reduction, that require a higher cathodic potential than the  photosynthetic reaction before.  Investigation of limited electrochemical communication To prove that the observed responses originate from the  light‐induced charge separation performed by active pro‐ tein  complexes  and  reflect  the  electrical  communication  between  the  isolated  protein  complexes,  a  control  meas‐ urement was performed with immobilised but inactivated  protein complexes (iPS1 and iPS2). The application of Vapp  resulted in a much lower background current (Figure 2, red  trace). In accordance to this, also ∆EBEa‐Sol  and ∆EBEc‐Sol are  significantly lower than for the active biomolecules.  Illumination  of  the  samples  did  not  cause  significant  changes  in  any  of  the  parameters,  because  no  photores‐ ponse was induced. For the SECM tip current, a decrease  was recorded, which can be explained by the previously de‐ scribed light‐induced O2 consumption by iPS2.28‐30 During  the  long‐term  illumination  period  no  significant  changes  were recorded for all four parameters either. Only the O2  reduction  current  slowly  decreased  as  the  O2  concentra‐ tion was diminished with time.  In order to demonstrate that the individual protein com‐ plex activity can be deduced from the course of potential  differences  upon  illumination  and  over  time,  and  to  de‐ monstrate the system’s working principle, several control  measurements have been carried out in which one of the  reactions  was  impaired.  First,  inactivated  PS2  was  com‐ bined with active PS1 (Figure 2, green trace). Upon appli‐ cation of the driving voltage at the feeder electrodes and in  dark conditions, all four parameters show very similar val‐ ues  to  the  measurement  with  inactivated  protein  com‐ plexes.  Under  illumination,  the  system  current  increased  minimally suggesting that iPS2 is limiting the bipolar cur‐ rent  considerably.  As  a  result,  ∆EBEa‐Sol  and  ∆EBEc‐Sol  are  shifted to more positive values to reach the maximal cur‐ rent possible. The cathodic potential difference is signifi‐ cantly decreased to adjust to the lower current that the an‐ odic side is able to deliver. And again, the SECM tip current  is decreased under light due to O2 photoconsumption. For  the long‐term irradiation period under Vapp, the same re‐ sponses are observed. As the light is switched off, all four  parameters  adjust  to  almost  the  initial  values  and  ∆EBE  slightly increases as the current decreases. 

 

Figure 2. Control measurements performed in the bipolar  setup for: iPS1+iPS2 (red), PS1+iPS2 (green) and in the absence  of MV2+ as redox mediator (blue). Sample illumination is indi‐ cated by the bright yellow background and the application of  0.6 V between the feeder electrodes is indicated by the shaded  boxes at the bottom and top of the graph. a) Current between  the feeder electrodes isys, b) current at the SECM tip iSECM, c)  interfacial potential difference between BEa and the solution  ∆EBEa‐Sol,  and  d)  interfacial  potential  difference  between  BEc  and the solution ∆EBEc‐Sol. 

5

ACS Paragon Plus Environment

Analytical Chemistry

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Second, the cathodic process was impaired by excluding  the redox mediator MV2+ (Figure 2, blue trace). In the ab‐ sence  of  the redox mediator in  solution O2  is directly re‐ duced at the FB site of PS1 but at a considerably slower rate.  Therefore, a lower current is expected in this case although  PS2 is assumed to be able to deliver a similar current as in  the  first  measurement.  When  Vapp  was  applied,  a  similar  background isys and ∆EBEc‐Sol value as in the measurements  with  iPS2  and  both  inactivated  protein  complexes  were  recorded. However, ∆EBEa‐Sol  levelled off at a similar value  than that observed for the PS1/PS2 measurement. Upon il‐ lumination,  the  system  current  shows  an  increase  of  0.5 µA, which lies  in between  the responses of  the meas‐ urements with active protein complexes and with inactive  PS2. The production of O2 monitored by the SECM tip re‐ flects an initially high reaction rate of PS2 that is immedi‐ ately limited by the capability of the cathode side to accept  electrons. This aligns with the overall potential drop across  the BE. Under light it is ∆EBEa‐Sol  that decreases to deliver  only the current that the impaired reduction reaction can  attain at a slightly higher potential than under dark condi‐ tions. The same behaviour is observed during the long illu‐ mination period where ∆EBEa‐Sol increases slowly, which can  be  ascribed  to  continuous  inactivation  of  PS2  over  time.  The  response  of  all  parameters  shows  that  the  electrical  communication  between  the  active  protein  complexes  takes place but is restricted by the electron transfer which  is limited at the reducing end of PS1. 

Page 6 of 8

We have shown that electrical communication between  immobilised PS1 and PS2 can be monitored and the protein  complex activity can be analysed for each BE pole individ‐ ually  while the  photoelectrochemical  cell  is in operation.  In case of high activity, high currents at high interfacial po‐ tential differences are observed. Here, the decrease of the  charge transfer resistance upon illumination leads to a de‐ crease in ∆EBE as isys increases by the photocurrent. Because  the potentials within the system are in equilibrium to ena‐ ble  the  maximal  possible  current,  the  changes  in  ∆EBE‐Sol  indicate which reaction limits the overall performance. In  this way, the potential difference for the non‐limiting reac‐ tion always decreases, while the potential difference for the  limiting reaction increases or remains constant. 

CONCLUSIONS We have presented a first electrochemical study on the  electrical  communication between PS1 and  PS2 both em‐ bedded  and  wired  to  the  underlying  electrode  using  the  same Os‐complex modified redox polymer using a closed  setup for bipolar electrochemistry. Extensive information  on  the  performance  of  the  photobioelectrochemical  cell  was obtained from four different parameters recorded sim‐ ultaneously. From the system current, isys, the in situ col‐ lection of O2 evolved at PS2, and the interfacial potential  differences  at  the  BE  poles,  the  protein  complex  limiting  the photocurrent can be derived. The experiments can be  seen as a combination of galvanostatic and potentiostatic  measurements. As the potentials within the system are in  equilibrium,  the  measured  potential  differences  are  con‐ tinuously  adjusted  in  dependence  on  the  activity  of  the  protein  complexes  to  achieve  the  maximal  possible  cur‐ rent. The proposed system allows to change and evaluate  experimental  conditions  for  each  photosystem‐modified  electrode  individually.  In  this  way,  the  effect  of  different  pH  values,  temperatures,  electron  acceptor  or  inhibitor  concentrations may be analysed. It is important to notice  that no membrane or salt bridge is required to connect the  two half‐cells as the bipolar reactions are counterbalanced  by the feeder electrode reactions. 

In  addition,  a  control  measurement  was  carried  out  in  which  only  PS1  has  been  inactivated  (Figure S‐1,  purple  trace). As soon as the light is switched on, isys increases by  approximately 0.16 µA. In accordance with the ∆EBE value,  this current as well as the SECM tip current are lower than  the values recorded in the absence of MV2+. Also here PS1  is limiting so that ∆EBEa‐Sol  decreases while ∆EBEc‐Sol for the  slower reaction slightly increases to reach the maximal cur‐ rent the system can achieve. At the end of the long illumi‐ nation phase, the currents and potential differences barely  change indicating that no photoactivity is left.  At last, a control measurement was performed, in which  both  half‐cells  were  working  at  the  same  pH  value  (Fig‐ ure S‐1,  orange  trace).  By  using  the  same  pH  value  as  for  the  PS2  half‐cell,  the  additional  pH‐related  potential  dif‐ ference that may influence the system’s response is elimi‐ nated. Because the optimal pH value for the PS1/Os‐P as‐ sembly is 4.0,26 a lower activity at the cathodic side is ex‐ pected  under  these  conditions.  In  this  measurement,  the  light‐induced system current is similar to the one obtained  for the measurement performed in the absence of MV2+ in  the buffer solution used for PS1. From the change in poten‐ tial differences with light, it can be seen that a pH value of  6.5  does  not  impair  the performance  of PS1,  but  only de‐ creases ∆EBE. While ∆EBEa‐Sol remains at the same value or  increases  slightly  under  illumination,  ∆EBEc‐Sol  decreases  just  as  observed  with  the  fully  active  photosystems.  The  lower driving force only decreases the maximum possible  current. Thus, also the SECM tip current is lower than for  the PS1/PS2 measurement. 

ASSOCIATED CONTENT Supporting  Information.  A  scheme  showing  the  standard  potentials  of  the  components  involved  in  the  system  is  pre‐ sented as well as a table with the detailed experimental proce‐ dure for the bipolar electrochemistry measurements. Moreo‐ ver, additional experimental data completing those shown in  the  manuscript  and  additional  control  experiments  are  in‐ cluded. This material is available free of charge via the Inter‐ net at http://pubs.acs.org. 

AUTHOR INFORMATION Corresponding Author * E‐mail: [email protected], phone: +49 234 322 5474.  * E‐mail: [email protected], phone: + 49 234 322  6200. Fax: + 49 234 321 4683. 

Author Contributions

6

ACS Paragon Plus Environment

Page 7 of 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Analytical Chemistry

All measurements were conducted by F.C. and V.E. using sam‐ ples prepared by F.Z. The manuscript was written by V.E. with  contributions  of  F.C.  and  F.Z.,  and  in  discussion  with  W.S.  V.H. and M.M.N. contributed isolated PS1 and PS2. All authors  have given approval to the final version of the manuscript. 

(13)  Kopnov, F.; Cohen‐Ofri, I.; Noy, D. Angew. Chem.  Int. Ed. 2011, 50, 12347–12350.  (14)  Zhang, X.; Zhai, Q.; Xing, H.; Li, J.; Wang, E. ACS  Sens. 2017, 2, 320–326.  (15)  Bouffier, L.; Ravaine, V.; Sojic, N.; Kuhn, A. Curr.  Opin. Colloid Interface Sci. 2016, 21, 57–64. 

Notes The authors declare no competing financial interest. 

(16) 

Inagi, S. Polym. J. 2015, 48, 39–44. 

(17)  Koefoed, L.; Pedersen, S. U.; Daasbjerg, K. Curr.  Opin. Electrochem. 2017, 2, 13–17. 

ACKNOWLEDGMENT This work was supported by the Deutsche Forschungsgemein‐ schaft (DFG) in the framework of the Cluster of Excellence Re‐ solv (EXC1069)  and  the  Deutsch‐Israelische  Projektkoopera‐ tion (DIP) in the framework of the project “Nanoengineered  Optoelectronics  with  Biomaterials  and  Bioinspired  Assem‐ blies”. The authors are grateful to the chair of Physical Chem‐ istry  I,  the  chair  of  MEMS  Materials,  and  Mr.  H.  Austenfeld  from the chair of Electronic Materials and Nanoelectronics at  the Ruhr‐Universität Bochum for their help with the Au wafer  fabrication. Moreover, S. Alsaoub and Dr. A. Ruff are acknowl‐ edged for the synthesis of the redox polymer, C. König for as‐ sistance  with  the  preparation  of  the  photsynthetic  protein  complexes, and Dr. N. Plumeré for valuable scientific discus‐ sion. V.E. and F.Z. express their gratitude to the German Na‐ tional  Academic  Foundation  and  to  the  China  Scholarship  Council (CSC), respectively, for their support. 

(18)  Zhang,  X.;  Chen,  C.;  Li,  J.;  Zhang,  L.;  Wang,  E.  Anal. Chem. 2013, 85, 5335–5339.  (19)  Eßmann, V.; Barwe, S.; Masa, J.; Schuhmann, W.  Anal. Chem. 2016, 88, 8835–8840.  (20)  Fosdick, S. E.; Knust, K. N.; Scida, K.; Crooks, R.  M. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 10438–10456.  (21)  Cox, J. T.; Guerrette, J. P.; Zhang, B. Anal. Chem.  2012, 84, 8797–8804.  (22)  Zhang, X.; Zhai, Q.; Xu, L.; Li, J.; Wang, E. J. Elec‐ troanal. Chem. 2016, 781, 15‐19.  (23)  Oja, S. M.; Zhang, B. ChemElectroChem 2016, 3,  457–464.  (24)  Sokol, K. P.; Mersch, D.; Hartmann, V.; Zhang, J.  Z.; Nowaczyk, M. M.; Rögner, M.; Ruff, A.; Schuhmann, W.;  Plumeré, N.; Reisner, E. Energy Environ. Sci. 2016, 9, 3698‐ 3709. 

REFERENCES (1)   Nelson,  N.;  Yocum,  C.  F.  Annu.  Rev.  Plant  Biol.  2006, 57, 521–565. 

(25)  Kuhl,  H.;  Kruip,  J.;  Seidler,  A.;  Krieger‐Liszkay,  A.;  Bunker,  M.;  Bald,  D.;  Scheidig,  A.  J.;  Rögner,  M.  J.   Bioanal. Chem. 2000, 275, 20652–20659. 

(2)  Cox, N.; Pantazis, D. A.; Neese, F.; Lubitz, W. In‐ terface Focus 2015, 5, 20150009. 

(26)  Kothe,  T.;  Pöller,  S.;  Zhao,  F.;  Fortgang,  P.;  Rögner,  M.;  Schuhmann,  W.;  Plumere,  N.  Chem.  Eur.  J.  2014, 20, 11029–11034. 

(3)  Schlau‐Cohen,  G.  S.  Interface  Focus  2015,  5,  20140088.  (4)  Nelson, N.; Junge, W. Annu. Rev. Biochem. 2015,  84, 659–683.  (5)  Badura,  A.;  Kothe,  T.;  Schuhmann,  W.;  Rögner,  M. Energy Environ. Sci. 2011, 4, 3263–3274. 

(27)  Mavré,  F.;  Chow,  K.‐F.;  Sheridan,  E.;  Chang,  B.‐ Y.; Crooks, J. A.; Crooks, R. M. Anal. Chem. 2009, 81, 6218– 6225. 

(6)  Nguyen, K.; Bruce, B. D. Biochim. Biophys. Acta  2014, 1837, 1553–1566. 

(28)  Khorobrykh, S. A.; Khorobrykh, A. A.; Klimov, V.  V.; Ivanov, B. N. Biochem. 2002, 67, 683–688.  

(7)  Kato, M.; Zhang, J. Z.; Paul, N.; Reisner, E. Chem.  Soc. Rev. 2014, 43, 6485–6497. 

(29)  Nowaczyk, M.  M.; Plumeré,  N.  Nat. Chem. Biol.  2016, 12, 990–991. 

(8)  Tel‐Vered, R.; Willner, I. ChemElectroChem 2014,  1, 1778–1797. 

(30)  Zhang, J. Z.; Sokol, K. P.; Paul, N.; Romero, E.; van  Grondelle, R.;  Reisner, E. Nat. Chem. Biol. 2016, 12, 1046– 1052. 

(9)  Badura, A.; Guschin, D.; Esper, B.; Kothe, T.; Neu‐ gebauer, S.; Schuhmann, W.; Rögner, M. Electroanal. 2008,  20, 1043–1047.  (10)  Badura, A.; Guschin, D.; Kothe, T.; Kopczak, M.  J.; Schuhmann, W.; Rögner, M. Energy Environ. Sci. 2011, 4,  2435–2440.  (11)  Kothe, T.; Plumeré, N.; Badura, A.; Nowaczyk, M.  M.;  Guschin,  D.  A.;  Rögner,  M.;  Schuhmann,  W.  Angew.  Chem. Int. Ed. 2013, 52, 14233–14236.  (12)  Hartmann,  V.;  Kothe,  T.;  Pöller,  S.;  El‐ Mohsnawy,  E.;  Nowaczyk,  M.  M.;  Plumeré,  N.;  Schuh‐ mann,  W.;  Rögner,  M. Phys. Chem. Chem. Phys. 2014,  16,  11936–11941. 

7

ACS Paragon Plus Environment

Analytical Chemistry

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

TOC graphic 86x61mm (300 x 300 DPI)

ACS Paragon Plus Environment

Page 8 of 8