ISOLEhlENT DE L'HIGENAMINE A PARTIR DE L'AASAY0S.-l SQUA AlOSA; INTERET DES RESINES XDSORBANTES MACROM 0LE CULA\I RE S E N CH I M I E YEGETALE EXTRACTIVE.' 3 I I C H E L LEBOEWet A K D R k c.lVk L a boraioire de Pharniucognosie, Faculti de P h a r v i u c i e , F-92290 C h u t e m y - d f u l a b r ~
A S D R ~T O E C HJEAS ~ , PROVOST et PIERRE FORGACS Centre de Recherches d e s Laboratoires R o g e r Bellon, F-94140 d l , f o r t ; ~ i l l e
RESTNE.-A partir des tiges feuillees d ' = l n n m o s q z ~ ~ i i i i oL., ~ o un alcaloide benzyltCtrahydroisoquinol@iqiie, l'higenamine 1 1J, dciie d'activite stimiilante $-adrenergique, a e t 6 isole. Sa synthise, ainsi q c e la prgparation de d6rivis 0-acyl&, sont decrites. L'interct des resines adsorbantes niacrcniolticulaires ncn pnlaires (.Amberlites X 4 D ) en chimie vCg6tale extractive est soriligne. ;iBsTR.wT.-Froni leaves and stems of d ~ ? i o ? i nsgiciiniosli L., liigenamine i l , , n benzyltetrahydroisoquinoline alkaloid, u-liicli is n n effective $-adrenergic agonist, has been isolated. Its synthesis, and 1l.e preparation of' its 0 - a c y l derivatives, are described. The use of adsorbent macrcn:olecular ncn-polar resins iAniberlites X-AL)) in extractive phytochemistry is emphasized.
L ' 1 m o t l a squamosa L. appartient a la famille des -4nnonac6es. sous-faniille des Annonoideae, tribu des Unoneae. sous-tribu des hnnonideae (1). Cette espice presente la particularitk liiutorique d'avoir et6 In premi2re ;innonac&e dkcrite, di.s 1546, par Oviedo so le nom de Guatiobaiio ( 2 ) ; celui-ci devait &tie a l'origine du genre Giroiiabaiiiis nbli par Plumier en l i 0 3 , puis rejet6 en 1 i 3 i par Linni. qui lui pr6fi.m .-lmotia (3j. Cc.rnn?e la plupait des espi.ces du genie A 4 ? i ~ f ol?' d~ .~ squamosa ~, est originaire d'ilrrc'iique tropicale, mais il est cultiv6 dans toutes les r6gions chaudes du globe, notarxrxent en Afrique et en Asie. C'est un arbuate ou un petit arbre de 5 a G rnGties, trGs tiranchu, a rameaux ]enticell& ; les feuilles. glnbres, sont vertes. 14gPiement glauques a la face infgrieure; les fleurs. blanchfitres. sont axillaires. isolees ou groupkes par deux; le fruit, sph6rique ou ovoide, mesure G A 10 cm de diamPtre; son kpiderme, gris-verdstre, est 6cailleux et mamelonne; sa chair. tlanche et molle, possPde une saveur sucrke et delicate; ce fruit, la pomme-cannelle ou atte, sn-eetsop pour les Anglo-Saxons, est comestible; sa qualit6 est bien superieure celle du corossol (soursop). fruit de corossolier, dniiona muricata L.: c'est un des meilleurs fruits des pays chauds (4, 5 ) . Des extraits de differents organes de l'drz~ionasquamosa ont en medecine locale traditionnelle des emplois variks et assez semblables a ceux de I ' d . muricata (4, 5, 6, i ) . Diverses proprigtes pharmacologiques d'extraits d ' d . squamosa ont et6 rapportees. C'est ainsi que la fraction hydrosoluble de l'extrait alcoolique de feuilles preeente une activite stimulante p-adrknergique ( 8 ) . Des extraits aqueux ou 6thanoliques sont spasmolytiques sur le duodenum du Lapin. mais provcquent un effet spaemogPne sur l'intestin du Cobaye et sont utbrotoniques ckez la Rate; ils montrent egalement des propri6tes p-stimulantes, cardio-vasculaires et respiratoires chez le Chat (9). Par ailleurs. une forte action ac6tylcholinomimetique est signalee pour les alcaloides totaux isol6s des feuilles (10)' tandis que des proprietks anticanc6reuses sont rapportkes pour l'extrait hydroalcoolique -____ 'Partie XXT-I1 dans la serie "Alcaloides des Annonac6es"; partie XXT.1: R . Hocquemiller, 6 . Rasamizafy, C. Moretti, H . Jacqueniin et A . CavC, Plnntri Medica (sous presse).
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de feuilles et d’kcorces (11). Pour certains auteurs, les extraits prCsentent une activitC antibiotique vis-a-vis de Staphylococcus aureus et Escherichia coli (12) ; ceci est infirm6 par d’autres (13). D’Cventuelles propriCtCs antiovulatoires, anticonceptionnelles, voire abortives, sont vivement controverskes: positives pour les uns (14, 15, 16)’ elles seraient negatives selon d’autres auteurs (13). Enfin, le pouvoir insecticide des graines, des feuilles et des racines semble bien Ctabli (13, 17). L’Ctude de la composition chimique de 1’A. squamosa a fait l’objet d’assez nombreux t r a v a w . Parmi les compos& neutres isolCs, on peut signaler en particulier une diazdpine originale, la squamolone (18)’ ainsi que plusieurs dCrivds terphiques B squelette kaurane (19, 20). Des alcaloides existent, a une teneur variable mais toujours faible, dans divers organes de la plante. D&s1925, Trimurti (21) signale la prCsence d’un alcaloide dans les feuilles; quelques annCes plus tard, Reyes et Santos (22) isolent a partir des graines une base aporphinique identifiCe a l’anonaine dkcouverte quelques mois auparavant chez A . reticulata. Beaucoup plus rdcemment, une investigation poussde du contenu alcaloidique est rCalisCe par plusieurs groupes de chercheurs. Yang et Chen (23) isolent des racines quatre alcaloides aporphiniques, une benzyltCtrahydroisoquinolCine, la rkticuline, et deux bases non identifides. A partir des tiges feuilldes, Bhakuni et coll. (24) extraient neuf alcaloides aporphiniques et une proaporphine, la normkcambrine. Quatre aporphines sont Cgalement identifikes dans les Ccorces par Iirishan Rao et coll. ( 2 5 ) , tandis que tr6s rCcemment Mukherjee et coll. (10) isolent a partir des feuilles une aporphine, une oxoaporphine et une benzyltktrah ydroisoquinolCine. Au cours de recherches entreprises dans notre Laboratoire sur la composition chimique et l’activitk biologique de diverses AnnonacCes, nous avons constat6 que les extraits hydro-alcooliques de tiges feujllCes d’A. squamosa originaire de 1’Inde prbsentent d’importantes propri6tCs bronchodilatatrices chez le Cobaye [technique de Konzett (26) 1, ainsi qu’une action cardiaque inotrope positive et chronotrope positive, mise en Cvidence sur l’oreillette isolCe de Lapin [techniques de Trevan (27) et de Salle (28) 1. I1 nous a donc semble intCressant d’isoler le principe actif responsable de ces activitks. Le fractionnement de l’extrait hydromkthanolique a CtC guidC B la fois par des essais pharmacodynamiques et par des essais physicochimiques (C.C.M.); il a CtC rCalisC en utilisant une m6thodologie particuli&re faisant appel B une rCsine adsorbante macromolCculaire non polaire.2 L’extrait aqueux est chromatographi6 sur colonne de rCsine Amberlite XAD,. Aprirs fixation, les produits hydrophiles non adsorb&, dont les sucres et les sels mineraux qui pertubent les essais pharmacodynamiques et les skparations chimiques, sont entrain& par des lavages r6pCtCs B l’eau distillCe. Les produits hydrophobes adsorb& sont 61uCs ensuite par de 1’Cthanol 2i 80”. Cet Cluat, seul actif sur les tests pharmacodynamiques, est alors chromatographi6 sur une rCsine cationique Amberlite I R C 50 en phase acide. Apr&s lavage de la rksine par du mkthanol, les produits basiques fix& sur la &sine sont 61uCs par du m6thanol chlorhydrique; le principe actif se trouve dans cette fraction. Le rCsidu, repris par du mkthanol, laisse cristalliser sous forme de chlorhydrate le produit recherchk qui est de nature alcaloidique (rendement : 800 mg/kg). L’examen de ses constantes physiques et de ses donnCes spectrales a permis fAmberlite XAD, (Soci6t6 Rohm e t Haas), dont la maille est un copolymbre polystyrhedivinylbenehe.
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de l'identifier A l'higknamine, 6,7,4'-trihydroxy 1,2,~3,4-tktrahydrobenzylhoquinolkine 1 ( 3 2 ) ; de formule brute CI,,Hl;SOI, sa structure est dkduite de mn spectre de masse (fragmentations A m z 164 et 107, caractkristiques d'uiie benzyltktrahydroisoquinolkine portant deux hydroxyleh phknoliques sur le cycle A et un autre sur le cycle C) et de soti spectre de R M S (absence de signal de S-m6thyle; prksence de 2 singulets de 1 proton chacuri A 6.64 et 6.80 ppm dub aux H en 6 et en 8 et d'un systhme A2 B2 ?6.79 i et 7.08 ppm iittribuable aux 4 H ell 2', 3 ' , 5', 6' (29). La synthke de l'higknamine a 6t6 r6aliske de fason classique, selon la mkthode de Bischler-Napieralski en 4 ktapes A partir de la 3, 4-dimkthoxyphknylkthylamine condenske avec l'acide para-m6thoxyphknylacktique; l'amide obtenu, 2, est cyclisk A l'aide d'oxychlorure de phosphore et1 la benzyldihydroisoquinolkine, 3, dorit l'hydrogknation catalytique conduit A la 1-paramkthoxybenzyl 6, 7-dim6thosy-1, R
RO
R
JJ
I
OMe
w
HO
-1 Higknamine
1 : R 5 : R 6 : R 7 : R
8
= H : Hig6namine = CH -CO 3 = (CH ) -C-CO
3 3
= CH -(CH 3
) -CO 2 2
: R = (CH3)2-CH-C0
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2, 3, 4-tktrahydroisoquinolkine, 4 ; sa 0-dkmkthylation, par l’acide bromhydrique en milieu acktique, fournit l’higknamine 1 identique au produit nature1 isolk, prouvant ainsi la structure de ce dernier. De plus, cette synth6se nous a procurk des quantitks importantes d’higknaniine, permettant de rkaliser son ktude pharmacologique et de prkparer plusieurs dkrivks hkmisynthktiques. Kotre but ktait de rechercher un dkrivk plus stable que l’highamine, a action plus prolongge, et surtout prksentant une activitk bronchodilatatrice import ante tout en ayant une composante cardiovasculaire moins niarquke. Quatre dkriv6s 0-acylks ont ktk ainsi prkparks: triacktyl 5 , tripivalopl 6, tributyroyl 7 et triisobutgroyl 8. S o s travaux ktaient en cours et ont kt6 arrhtks lorsque nous avons eu connaissance de brevets japonais (30) revendiquent la prkparation et l’activitk cardiovasculaire de 0-acylhigknamines. DISCUSSIOS Avant le prksent travail, l’higknamine n’a ktk, a notre connaissance, isolke qu’a partir de trois sources vkgktales: embryons de graines de Selumbo ?lztcijera Kymphkackes (31)’ racines d’..lcoizitum japoizicum, Renonculackes (32, 33) et racines d’Asiasarum ( = Asarum) heterotropoides var. maiidshuricum, Asarackes ( = Aristolochiac4es) (34). La prksence de l’higknamine chez une Annonacke n’a jamais ktk signalee jusqu’a prksent. Cette distribution botanique de l’higknamine ne doit pas cependant surprendre, puisque de nombreuses esp6ces de ces quatre familles renferment des alcaloides isoquinol&ques, en particulier de type aporphinique (35). Ces liens chimiotaxinoniiques vont dans le sens des relations phylogenktiques existant entre l’ordre des llagnoliales, auquel appartiennent les Annonackes et les Aristolochiales, les Sympkkales et les Kanunculales : selon Takhtajan (36) ces trois derniers ordres dkrivent directement de celui des llagnoliales.
La (*)-higknamine, qui est la (*)-dkmkthylcoclaurine, a ktk synthktiske des 1958 par Yamaguchi (37); les knantiomhes (+) et ( - ) ont kgalement ktk prkparks par Rametani et coll. (3s). L’higknamine est tr&s instable en milieu alcalin; sa demi-vie, la tempkrature ambiante, ne serait que de 4.5 minutes a p H 8 et moins de 10 minutes a p H 9. Cette instabilitk, ainsi que ses solubilitks un peu particuli&rcs,expliquent les difficult& de son isole ment e t il cst probable que l’higknamine est keaucoup plus rkpandue dans le rPgne vkgktal que ne le laissent supposer les publications existantes. n’ous avons d’ailleurs, pour notre part. observk que l’higknamine n’est pas prksente dans lee alcaloides totaux de 1’Antzona squamosa extraits de fason classique par un solvant organique en milieu alcalin. Kosuge et Yokota (32) ont supposk que chez Acoiiitum japonicum l’higknamine est probablement stabiliske, dans le vkgktal et durant l’extraction, par un glucoside acide particulier, le yokonoside, agissant A la fois comme agent salifiant et comme antioxydant . D’un point de vue pharmacologique, l’higknamine est un stimulant p-adrknergique puissant; son action se manifeste particuli6rement sur le coeur (effet inotrope positif) et les bronches (bronchodilatation) (33, 34, 39) ; son activitk est nettement plus marquee que celle de l’alcaloide 6-0-mkthglk correspondant, la coclaurine. Cette diff krence d’intensitk d’action a ktk expliquke rkcemment (39) par une ktude cristallographique aux rayons X, qui permet de supposer une
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meilleure liaison entre le recepteur et 1’0-(6)-H de l’higenamine par comparaison avec 1’0-(6)-XIe de la coclaurine. Outre l’int6ri.t que prCsente l’isolenient de l’higenamine a partir d’dnnona sqziamosa. il nous parait important d’insister sur les avantages que comporte l’utilisation des resines adsorbantes macromoleculaires (-imberlites XAD) en chimie vkggtale extractive. D’introduction recente en analyse chimique et biochimique, ces resines n’ont r e p que peu d’applications dans l’enrichissement et la separation de substances vkgetales pharmacologiquenient actives. On peut citer, a titre d’exemple3.. l’isolement des makisterones, stkroides polyhydroxyl& du Podocarpus macrophyllus (40). la separation de steroides vegetaux (41) et de flavonosides (42). la purification du stgvioside contenu dans Stetia rebaudiapia ( 3 3 ) . l‘isolement a partir de Seuecio amba.iilla d’esters de l’acide l-hydroxy +oxo 2 5-cyclohexadienyl-ac6lique et du glucose. d o d s de proprigtes antidcereuses gastriques (44). Dan5 le domaine des alcaloides. lee -4mberlites XAD, ont et6 utilisees pour la purification de l‘extrait de Coptis chi7reasis (45) et la separation d’alcaloideb pyrrolizidiniques de5 Borraginacees (48) ; elles ont permis la mise en kvidence de sels de ni6thylh\ drastinium dans les extraits de Fzimaria pariijlora. dont le traitement habitue1 d’extraction des alcaloides par les agents alcaliiis conduit a la formation d’artgfacts (46). Dans le cas de l‘higenamine. il est peut-&re interessant de coniparer deux niethodes d’estraction: celle. assez complexe, mise en oeuvre par Kosuge et Tokota ( 3 2 ) (qui isolent 100 nig d’higenamine a partir de 150 kg de racines d’.Icoiiitzim j a p o n i c u m ; la n6tre. qui est une application de In &sine Amberlite XAD,, permettant d’obtenir a partir d’z4ji?rmzasquamosa 100 mg d’higenamine par kg de drogue &he par une technique simple (cf. schema). Les rendements en piincipe actif n’ont evidemment qu’une valeur relative puisque le. esemples cites dans le tableau concernent deux plantes diff 6renteq. Cependant nous avons constat6 dans no3 essais que le fait de prockder a des extractions nvec le melange butanol-eau (1-1) entraine une perte d’environ 50% de l’higenamine par suite d’une dispersion de l’alcaloide dans les deux solvanto. Cette remarque. qui montre l’int&r&t de l’emploi de 1’Amberlite XAD2 par rapport a des techniques classiques d’extraction liquide-liquide, peut laisser supposer que les teneurs en highamine dans les embryons de Selzimbo izucifera [I90 mg kg, (31) 1. ainsi que dans les racines d’..lcoizitum j a p o n i c u m [0.66 mg kg, (32, 33) ] et d ’ i l s i a s a r u m heterotropoides [I5 mg kg, (34) 1. sont probablement superieures a celles qui ont 6tC publikes. Enfin. outre 1’acci.s facile a l’alcaloide responsable de l’activitk cardiovasculaire de l’rlnrrona squamosa, l’emploi de la resine Amberlite XAD, nous a permis d’isoler d’autres constituants, soit a partir de l’kluat aqueux, soit a partir de l’kluat alcooliyue. Dans le premier, il a et6 procede en particulier a l’identification et au dosage (analyseur automatique Technicon) des acides amines; ils sont identiques A ceux rencontres habituellement dans le regne vegetal. D’autre part. des fractionnements eff ectugs sur l’eluat alcoolique ont conduit a l’isolement d’un flavonoside banal, le rutoside, et surtout A la decouverte d’un hCt6roside aromatique nitrC original. le (4’-primev6ro~yl)-l-ph6nyl-2-nitro ethane. dont la description fait l’objet d’une publication s6paree (47). En conclusion. l’int6rCt que presentent le:: resines Amberlite XAD pour l’enrichibsement et la separation de substances varikes, hydrophiles ou hydrophobes, a partir d’extraits vegbtaux complexes, nous incite a penser que l’utilisation de ces adsorbants particuliers meriterait d’i.tre dCvelopp6e en phytochimie extractive.
,JOUHKAL ov NATUKAL ~'ROUUCTS
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SCHEMA COhlPAI?ATIF DE D E U X MOIIES 11'EXTItACTIOK 1)E L ' H I G E N A h l I N E Tiges feuillees d ' d nnonct sqiruniosii? (1 Kg)
Racines d'A conilum jciponictcml
c
+
Kg) Extrait mkthanolique I CHCl,/HzO
Extrait LIeOH-HsO (60-40) Concentration
1
I
t
Extrait aquerix
Hz0
I
Extraction a contre-courant (n= 10; n-BuOH-HZO)
t Fraction active
1
--Adsorption sur Amberlite
XADz
-Elution par E t O H 80%
Fraction active
Filtration sur Sephadex L H 20
Fraction active (MeOH)
I
-Elution
par hleOH
Extraction B contre-courant (n = 25; n-BuOH-HpO Fraction active
I
Fraction active
I 1
Filtration sur Sephadex L H 20
Fraction active
Cristallisation hleOH
Chlorhydrate d'higknamine : 800 mg (Rendement : 800 mg/Kg)
Extraction a contre-courant (n=20; n-BuOH-HC1 0.1 K)
Chlorhydrate d'higenamine : 100 mg (Rendement : 0.66 mg/Kg) 'D'apres T. Kosuge e t h l . Yokota (32). 2Pr6sent travail.
PARTIE EXPERIMENTALE ISOLEMEST DE L'HIGhK.iMIXE.-La
poudre de tiges feuillCes sCchCes (1 kg) d'dnnonu sqztu-
w o s o irCcolt6es en Inde, dans le district d'Indore, au mois de fCvrier) est placCe dans un per-
colateur et 1ixiviCe par 15 litres d'im mClange mCthano1-eau 60-40. Le mCthanol est chassC e t l'on concentre sous pression rCduite la phase aqueuse jusqu'8 un volume de 2 litres. Apr& elimination d'un insoluble (16.5 g) et lavages par du chloroforme (3 x 200 ml), l'extrait aqueux (pH 5.1) est adsorb6 sur une colonne de resine Amberlite X;ID? (volume de rCsine: 1.3 litre; rapport hauteurldiamktre de la colonne: 1 1 ) ; le lit de rCsine est 1avC par de l'eau distillee (5 litres) pour Climiner les produits non adsorbis (117 9 ) ; 1'Clution des substances adsorbees est rCalisCe par passage d'ethanol a 80% (4 litres) sur la colonne: le solvant, CvaporC sous pression rCduite, laisse un rCsidu de 34.5 g. Ce rCsidu est repris par du mCthanol (350 m l ) ; un insoluble (8 g) est CcartC. La solution mCthanolique est fixtie sur line colonne de rCsine Amberlite I R C 50 en phase acide. Apr& Climination des produits non fix& (25 p) par lavage de la colonne par du mCthanol (350 ml), la fraction basique est CluCe par une solution (200 ml) de methanol chlorhydrique i2%. L'Cluat, concentrC B sec, fournit un resid11 (1.1 g) qui est repris par du mkthanol (2.5 m l ) ; la solution est abandonnee 12 h h 0"; on isole ainsi 0.80 g de cristaux constituCs par du chlorhydrate d'highamine ipeu pres pur qui est ensuite recristallis6 dans I'eau distillCe.
H I G ~ K A M I.-Chlorhydrate: INE cristanx incolores, C16Hl;K03, HC1=307,76: F (tube capil~ 0"; uv (Unicam SP 1800, E t O H ) : X max laire, appareil Buchi-Tottoli): 280' (dCc.): [ a ](H,O): 228 e t 287 (log 4.12 et 3.68); Base: rmn (Yarian T 60, 60 MHz, CD C1, 5 gouttes CbDjN, 6 ppm/TMS): 2 s B 6.64 e t 6.80 ( H en 6 et 8), systkme A2 B2 Q 6.79 et 7.08, J = 9 Hz (H en 2 ' , 3 ' , 5'
+
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LEBOEUF ET A L . :
HIGESrl.\llSE
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et 6 ' ) ; sm (I-arian Mat 112, 70 e l . ) : nz 2 161 (loOL;j j 149 [ 3 c ! ; ) , 107 (95;); l'ion muleculaire (ni 'r 271) n'est pas observe sur le spectre de masse. STSTHESEI)E L'HIGB wrsE.-La 3,4-dimet h o s y p h ~ i i y l ~ t h y l a m i n110 e g) est condensee avec l'acide pcirii-metho. plienylacetiqiie (10 gi par cliauffage B reflux 45 minutes dans la tetraline (50 m l ) : l'amide 2 cristallise dans le milieii reactionnel: F 121' 1l:dt 92:; i . Vne soliitic]n henzeniqiie (SO nil) de 2 ilC.80 g~ est pcir16e a11 refliix, et l'on introdiiit POCISen soliiticrn dans dri henzine (48 nil d'iine soliltion h X ' , i : le reflrix est maintenii 1 I i e i i w : le clilorliydrate dr la t~enzyldihydrciisc,qiii~i~~~6i1ie, 3, cristallise npis rel'roidissement dii niilieii r6actiemnel: F 195: (Itdt !3jciI . Une soliition de 3 i l ( i . E O g J tlans de I't3lianol (2CO 11111. est agi1i.e soiis Iiydrogine, en prisciice de cat alyserir (1 g de Pt O r ) , jiisqii'h [in d'ahsorpt i r i i i d'hydrcigine: a t ~la benzyltbtraapri,s Imsoragc dri cat alyseiir et concent rat ion dii scilvant, le c l ~ l t r i ~ h y d r de ]i!-droisciyi~inoli.ine, -1, cristallise: F 195' (1:dt 85,'; I . -4line sollition de .1 (10 g j dans de l'acide aci-liqiie i30mlj, on ajoiite i i n p strliition n c i t i q l , e a 4CC; de I1Br ilOmli, piiisiine suliition aqiieiise de H B r (10 mli: le melange rbactionnel est chaiiff6 4 h a refliis: apris refroidissement, I'liig6namine 1 rristailise scliis forme de hrcmhydrate: F 2F5' 1l:dt 8Cs I . Le bromhydrate d'higbn:iniiiici est transform6 en chlorliydrate apris passnge internibdinire par l'higc'namine-base. S T H i h E D E S C H I . O I ~ H ID I t . \ l E h IIE O-.i( 1 - I . H 1 ( . 8 ~ - . \ ~ 1 l S E . - C i n q (0.014 molej de bi-Omliytlrate d'higenaniine sunt mis en solut ion d a n s 15 ml d'acide trifliioriric6tique. Le chloriire d'acyle (0.14 mole I est introdiiit et on laisse soiis agitation 48 lietires a tempi'rature amhiante. Le milieu rCactionnel est jete sirr d e In glnce p i l k : o n alcalinise a p I i 8.5 par ?;HIOH et on extrait par du chloroforme. Celiii-ci est lave l i I'eaii, si.cli6 siir S a 2 P 0 , et ivapore sous pressiun rbdiiite. Le ri-sidu est repris par de l'i.tlrnncll rlilorlij-diiqiie:le clilorhydrate cristallise et est recueilli. Chlorliydrate de O-triacet!.lhig~iiaIiiiIie 5 : I:dt 80r;: C22112306?;, HCI: F 215-217" :2C(iz i3011. Chlorhj-drate de O-tripivnl~ij~lt~igi'iianiiiie 6 : I?dt TOc; : C,1lI41SO~,HCI: F 258200'. Chlorliydrate de O-t~ihiityroylhig6naniine7 : E d t 7 3 ' ; C2,113jSO~IHC1: F 175'. Chlorhydrare de 0-triisohiityroylhigenamine8 : I:dt 70';; C ~ , H ~ ~ SHOCBl :,F 228-230". ~
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